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“瘤苗”——细胞因子转导入肿瘤细胞

2007/03/05 13:52   来源:医生在线

“瘤苗”——细胞因子转导入肿瘤细胞
  《生物工程进展》1999年9卷第4期

陈诗书
(上海第二医科大学 生化教研室 分子生物学实验室 人类基因治疗研究中心)
   关键词:肿瘤 基因治疗 “瘤苗” 基因转导
  Ⅰ 基因治疗的现状
  自1990年9月美国国立卫生研究院(NIH)及食品药物管理局(FDA)批准前列个腺苷酸脱氨酸缺乏-严重联合免疫缺陷症(ADA-SCID)临床基因治疗草案至今正好10年。从美国John Wiley & Sons出版社网站1999年6月发布的一些信息,可以了解这10年国际上有关基因治疗研究(指临床)进展的概况。包括我国在内全世界已有21国家开展基因治疗临床试验,现有380个临床治疗草案,参加治疗的病人有3173人,从其公布的数据可以反映一些当前基因治疗的现状。
  1.基因治疗的类型:目前临床进行的基因治疗仅限于体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy),生殖细胞由于生物学的复杂性及一系列伦理学问题,故未开展。
  统称的基因治疗,包括下面三类:

类 型

临床草案(%)

病人数(%)

  治疗性

  337(88.7%)

  2940(92.7%)

  标记(marker)

  41(10.8%)

  227(7.2%)

  非治疗性

  2(0.5%)

  6(0.2%)

  共计

  380

  3173
  非治疗性,即在健康自愿者注射腺病毒载体,观察其对人体的免疫反应。
  2.病种:主要集中三大病种,恶性肿瘤240项(70.9%),单基因遗传疾病(15种)53项(16.1%),传染病(AIDS)31项(9.1%),其它(心血管疾病、类风湿等)13项(3.9%)。
  上述疾病的基因治疗,大多数处于临床Ⅰ期试验,目前只有二项草案进入临床Ⅲ期试验,一项由美国Maria博士主持的神经胶质瘤的单纯疱疹胸苷激酶/9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(SHV-tk/GCV)“自杀”基因系统,自1996年8月开始,现正在北美和欧洲40多个中心拟收治250例病人,另一项是1998年由Thompson博士主持的用HLAB7治疗恶性黑色素瘤患者。
  迄今为止,尚无有关基因治疗确切疗效的报道。
  3.治疗方式:主要有两种方式,一是将体细胞取出体外培养、扩增,并导入外源性治疗基因,然后将这种经基因转导的体细胞输回病人体内,使带外源基因的细胞在体内表达,以达到治疗目的,称为ex vivo体细胞基因治疗,所用的细胞绝大多数为自体的细胞,如多种肿瘤细胞,成纤维细胞、淋巴细胞等,也有用同种异体的体细胞,个别甚至用异种动物细胞,如非洲长臂猿肾细胞(Vero)及幼田鼠肾细胞(HBK)。另一种是将外源基因通过多种途径导至体内有关部位的组织器管,使其进入相应细胞表达,称为原位(in situ)体细胞基因治疗。Anderson教授期望能将外源基因直接由血循环注入,进行体内(invivo)体细胞基因治疗,但目前尚无可供临床血液注射用的携带外源基因的载体[1]
  4.导入的外源基因:约80种靶基因已用于人体基因治疗,应用较多的有如下几类:⑴细胞因子:IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、IFN-γ、GM-CSF。⑵抗原基因:HIV-env, rev和gp100,肿瘤抗原CEA、MART、PSA和HLA-B7等。⑶缺陷基因:CFTR、ADA、FIX、LDLR等,⑷自杀基因:HSV-tk、E.Coli-CD、链球菌内毒素B。⑸标记:NeoR、LacZ和抗潮霉素基因。⑹其它如抑癌基因,抗药性基因,VEGF等。
  5.载体系统:要将外源基因导入体细胞,需要有效的运载基因的工具,即所谓的载体,理想的载体要求外源基因能靶向特定组织细胞,长期效果很好表达,可调控,安全可靠,这是当前基因治疗研究面临具有挑战性及困难的问题,目前所用的载体约50%为逆转录病毒,15%为腺病毒,少数为腺相关病毒,痘苗病毒、HSV等,20%为非病毒体系,较常用的为阳离子脂质体,少数用祼DNA直接注射,或用基因枪。
  Ⅱ 恶性肿瘤基因治疗的策略
  恶性肿瘤属复杂基因(complex genetic)疾病,至今只有部分基因被鉴定,肿瘤发生和发展的分子机制尚未清楚,因此,治疗时应选择何种靶基因不明确,根据美国NIH重组DNA咨询委员会1998年6月报告中列出的数据,对恶性肿瘤基因治疗大致有9种策略[2]
恶性肿瘤基因治疗策略

治疗策略

项目数

1 反义技术

4

2 化疗保护

8

3 免疫基因治疗/ex vivo

49

4 免疫基因治疗/in situ

40

5 前药/HSV-tk/GCV

26

6 肿瘤抑制基因

14

7 单链抗体

2

8 癌基因下调

2

9 腺病毒介导癌细胞裂解

2

共计

147
  上述种种治疗方案均在试验阶段,疗效尚无定论。免疫基因治疗约占总临床草案的2/3,其中ex vivo体细胞基因治疗,将一些细胞因子如IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IFN-γ和GM-CSF等基因,在体外经逆转录病毒介导入自体或异体的肿瘤细胞,作为“瘤苗”注射于病人,由于细胞因子的分泌,改变肿瘤局部的微环境,增强宿主的抗肿瘤免疫反应(如增强CD4+和CD8+细胞),和非特异免疫反应(如巨噬细胞、NK、LAK等)。有人将细胞因子基因转导成纤维细胞,再与肿瘤细胞混合注射于肿瘤局部,甚至应用异种转基因的动物细胞。这种策略已用于多种恶性肿瘤的基因治疗,如黑色素瘤,肾细胞瘤,肺癌,前列腺癌、结肠癌、淋巴瘤、成神经细胞瘤。一般无明显毒副反应,病人免疫反应有所增强,瘤块可缩小,但受试者多数为终期病人,疗效尚无定论。
  本实验针对我国二种常见恶性肿瘤,肝癌胃癌进行“瘤苗”研究。
Ⅲ细胞因子基因转导肿瘤细胞的建立
  一般先制备所需的细胞因子基因cDNA,将其克隆至合适逆转录病毒载体,包装成重组缺陷型逆转录病毒颗粒,用以感染肿瘤细胞,对转导肿瘤细胞进行分子生物学和生物学行为分析,较后经60Co照射,安全检测后,即成为“瘤苗”,其过程如下所示

能成活(1~2周),不繁殖,不致瘤
不应含有具复制能力的逆转录病毒
能分泌有效量的的细胞因子
  1.细胞因子基因的克隆 根据产生细胞因子的主要细胞类型,分离外周血单核细胞或小鼠脾脏细胞,经相应的激活剂,如ConA刺激,使之表达细胞因子。根据所要克隆细胞因子基因(cDNA)的序列,一般在Genbank都可查到,设计合适引物,以扩增包括信号肽序列的cDNA,同时根据所选择的逆转录病毒插入部位,在引物的5'端附加适当的限制性内切酶位点[3-6],经RT-PCR扩增,可获得相应的细胞因子cDNA,较后测序证实。
  2.重组逆转录病毒载体构建:LN系列是常用的缺陷型转录病毒载体,已被美国FDA批准可用于临床试验,细胞因子基因受5'-LTR启动,筛选标记基因NeoR受5'-LTR和内启动子SV40调控,为了能同时表达更多的细胞因子基因,或者含有双亚基的基因,我们利用脑炎心肌炎病毒(EMCV)和脊髓灰质炎病毒(Polio)的内核糖体进入位点(IRES)元件来构建多顺反子逆转录病毒载体。
  3.重组逆转录病毒的包装:将重组逆转录病毒载体DNA,通过磷酸钙沉淀或者脂质体转染双嗜性包装细胞PA317,该细胞整合着逆转录病毒PAM3基因组,除包装信号缺失外,5'LTR部位缺失,3'LTR被SV40的polyA取代,这种包装结构与载体至少要经过两次独立重组才能形成具有复制能力的逆转录病毒(RCR),安全性高,病毒滴度为105~106cfu/ml[8]
  4.肿瘤细胞转导及安全性检测:为便于应用,目前我们采用的细胞为同种异体,但至少要求有一个HLA I类分子位点与患者相同,所以肿瘤细胞转导前需经HLA定型,但常规方法不适用肿瘤细胞的定型,我们建立一个适合于肿瘤细胞HLA定型的间接淋巴细胞毒和流式细胞免疫荧光抗体标记法[9],取5×105对数生长期肿瘤细胞,用含4~8μg Polybrene和重组病毒上清感染细胞,其感染复数(MOI)=1,37℃培养6~8小时后,用0.4~0.8mg/ml G418进行筛选,直至出现抗性克隆,挑选克隆并进一步扩增供实验。
  作为基因治疗用的“瘤苗”,除符合一般生物制品的条件要求外,特别注意是否有RCR的存在,若有RCR存在,应用时有插入突变的危险。我们通过三种方法来检测RCR。⑴用PCR测定转导细胞DNA是否有env基因的存在,若有,说明有RCR污染,该法可检测1/105阳性细胞;⑵用经典病毒法S+L-方法;⑶标记拯救方法[10],我们实验室建立了一株含NeoR和LacZ双标记基因的细胞株[11]
  Ⅳ 细胞因子基因细胞转导肿瘤细胞的鉴定
  获得的G418抗性克隆表明NeoR 基因已稳定整合至该转导细胞基因组中,并能传代及表达。转入的其它外源基因如细胞因子cDNA是否存在于转导的肿瘤细胞中,是否能表达,一般通过DNA,mRNA及蛋白质等三个水平来检测外源基因的整合和表达。
  1.外源基因在转导肿瘤细胞中的整合:先抽提少量转导细胞的DNA,进行PCR和Southern印迹分析,根据转导细胞因子cDNA的种类,设计的引物应跨越不同外显子,以避免内源细胞因子基因的影响,结果都能获得预期大小的扩增片段。在进行Southern印迹,酶解DNA时,我们常采用5'和3'LTR的单一位点内切酶,如SacI或KpnI,并且这种酶位点在插入基因部分不含有。探针常采用NeoR基因,因哺乳类细胞不含该基因,可以减低本底,结果都能获得单一重组载体大小相似的杂交条带,证明转入的外源基因已整合至宿主细胞的基因组中及未发生重排[12]
  2.外源基因在mRNA水平上的表达,抽提转基因细胞的总RNA,进行RT-PCR和Northern印迹,以了解转入基因在mRNA的表达情况,也可了解转录物的大小。内启动子载体LN系列转录时产生两条mRNA链,一条是从5'-LTR启动子起始的全长mRNA,另一条为从内部启动子起始的含下游基因的mRNA,所以Northern印迹时,以NeoR做探针,可获得一条3.5kb左右和一条1.2kb的杂交条带。而利用IRES构建的多顺反子逆转录病毒载体,仅转录产生由5'-LTR启动的单一全长mRNA链,在翻译蛋白质时,上游基因通过真核的帽依赖方式翻译蛋白质,而下游基因则以IRES非帽信赖依赖方式翻译[7]
  3.外源基因在蛋白质水平的表达:常先用含有LacZ的重组逆转录病毒进行实验,用X-gal染色法或抗-β-半乳糖苷酶单抗的组织化学方法来检测LacZ的蛋白质水平表达。细胞因子基因或其它外源基因,常用Western印迹法,组织化学或ELISA方法来测定蛋白质的表达及表达量,例如IL-12的表达量为10ng/106细胞/48小时[6]
  Ⅴ 细胞因子基因转导肿瘤细胞的生物学行为
  1.形态结构:转导细胞因子后,光镜及透射电镜观察未发现明显变化,超微结构也无明显变化,但扫描电镜可观察到IFN-γ基因转导的肿瘤细胞表面微绒毛变细变长。有时在IL-2基因转导的H22小鼠肝癌细胞,出现细胞皱缩,细胞质膜泡起,染色质浓缩等凋亡现象[13]
  2.具有生物学活性细胞因子的分泌,用相应细胞因子活性测定方法,来检测转基因细胞培养液中细胞因子的活性,IL-2的生物活性用IL-2依赖细胞株CTLL来进行检测[7],TNF-α则用L929细胞毒性试验[7],IFN-γ活性用细胞病变抑制法[5],IL-12的活性则通过IL-12单克隆抗体捕获刺激淋巴细胞增殖法[6],实验结果表明外源细胞因子基因在转导的肿瘤表达蛋白质产物均具有生物学活性[5,6,7],如表1和表2所示。
表1 LXSN载体介导基因转导肿瘤细胞分泌的细胞因子(U/1×106cells/24h)

Cytokine

LXSN Vector

MKN45/ TNF-α

MKN45/ IL-12

HHCL/TNF-α

HHCL/IL-2

TNF-α

1500~2000

-

1000~2500

-

IL-12

-

500~600

-

400~600
表2 多顺反子载体介导基因转导肿瘤细胞分泌的细胞因子(U/2×105cells/24h)


Cyiokine

Bicistronic Vector

Tricistronic Vector

HepG1/TNF

HepG1/IL-12

MM45T.Li/TNF-αa

MM45T.Li/
  IL-12a

HepG1/TRI

MM45T.Li/ TRIa

TNF-α

2880

-

5100

-

960~4800

1600

IL-12

-

480~1920

-

300

84~1920

200
  a.1×106cells/24h
  3.MHC分子的表达 MHC分子在免疫反应起着中心地位的作用,提呈蛋白类抗原肽给T细胞或B细胞识别,从而发动免疫反应,肿瘤细胞往往免疫原性低降,提高肿瘤细胞的免疫原性,可能是增强机体的抗肿瘤免疫反应的一种措施,肿瘤细胞经细胞因子基因修饰后,表面MHC分子有不同程度的增加,其中尤以IFN-γ作用较强,MHC I类分子的平均荧光强度增加3~5倍,II类分子表达阳性率由<10%增加至>50%[14-17]。一般转导细胞基因的肿瘤细胞能持续表达高水平MHC分子,即使冻存,复苏后仍然可表达高水平MHC分子。
  但我们在实验中曾发现转导IFN-γ基因的人胃癌细胞株MKN-45,刚转导后MHC I和II类抗原表达都有升高,但连续传代培养三个月后,MHC I和II类抗原水平又回落到转导前的水平,经基因的分析,发现导入的IFN-γ cDNA已被删除[18]
  4.转基因肿瘤细胞刺激的细胞毒试验。上述人肿瘤细胞经细胞因子转导后,其表面MHC I和II类分子均获得了不同程度的增加,但是否能相应地增加肿瘤抗原肽的提呈,从而有利于激活机体抗肿瘤免疫反应,尚缺乏直接证据,我们试用60Co照射灭活的转导基因肿瘤细胞作为抗原刺激,能在体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL),而且要求一定的MHC I类分子匹配[17]
  5.转基因肿瘤细胞的致瘤性:将等细胞数的细胞因子转导前后的人肿瘤细胞,接种于裸鼠皮下,每周观察肿瘤生长情况,第六周时杀死裸鼠,解剖肿瘤并称重,结果发现细胞因子转导的人肿瘤细胞在裸鼠体内致瘤性有明显下降,特别是转导TNF-α基因的肿瘤细胞较为明显[14]
  6.照射对转基因肿瘤细胞的影响,为了在人体应用方便及安全起见,将转基因肿瘤细胞经60Co 100Gy照射后,液氮冻存,再复苏,结果发现,照射冻存复苏后,细胞因子尚能持续分泌2~3周,但细胞已丧失增殖能力,致瘤性也完全消失[19,20]
  总结以上所述,转导细胞因子基因的肿瘤细胞,免疫原性有所提高,能持续分泌细胞因子以造成有利于抗肿瘤反应的微环境,经60Co照射后,致瘤性丧失,因而具有作为治疗用的“瘤苗”的条件。
  Ⅶ 细胞因子基因转导肿瘤细胞的基因表达图谱变化[21]
  细胞因子基因转导肿瘤细胞后,可使其一些生物学行为发生变化,这些变化的基因基础是什么?哪些可能和抑制肿瘤有关?哪些又可能促进肿瘤的发生和发展?前已述及现已有数千人的体细胞中含有外源基因,这些外源基因除表达预期的产物外,对细胞有何影响,尚未见报道,因此探讨转导外源基因后其生物行为的分子机制,不但具有理论意义,而且从实际上可为优化肿瘤免疫基因治疗提供理论依据。
  我们选用IFN-γ基因转导的人肝癌细胞株HepG1作为模型,研究IFN-γ基因转导前后肝癌细胞基因表达图谱的差异,采用二个策略,先用Clonetech.Inc。提供的Atlas Cancer cDNA Expression Arrays即基因表达阵列或方阵,以比较转导前后肿瘤细胞与肿瘤发生发展,转移、浸润、细胞表面分子、相关性抗原受体,癌基因、抑癌基因、凋亡等有关588种基因的表达是否有变化。在此基础上,采用抑制性差减杂交法(SSH)研究有没有除上述588种已知基因以外的基因表达差别。
  1.阵列比较结果:总体来看,IFN-γ下调基因表达涉及的范围要比上调基因的广泛。IFN-γ调节细胞周期及细胞凋亡的基因较为广泛,提示IFN-γ的抗肿瘤作用机理可能与它可以强力调节细胞期速度和平衡细胞凋亡事件的发生有关。IFN-γ还可以上调某些抑癌基因,下调某些癌胚蛋白基因来协同它的抗肿瘤效应。此外,下调某些整合素,胶原蛋白的基因,来减缓肿瘤的浸润性。
  2.SSH结果:在正向(IFN-γ转导)和反向(未转基因)文库中选出19个克隆,其中7个克隆经酶切鉴定,回复实验,序列测定和同源性分析
  正向文库3个克隆,U2B”(U2小核核糖酸结合B”抗原);小G(X)蛋白(ras家族成员),MHC II类抗原。
  反向文库4个克隆,乳腺肿瘤蛋白(在肿瘤组织广泛表达的蛋白),16S rRNA,核糖体L21和eIF3。其生理意义有待进一步深入探讨。
参考文献
  1 Anderson WF.Human Gene Therapy, Nature, 1998,392,25-30
  2 Regulatory Issues: Data management report of the NIH Recombinant DNA Advisory committee Meeting on June 18-19,1998. Human Gene Therapy, 1998,9:2143-2161
  3 孙洁提,钱关祥,陈诗书,等,生物化学与生物物理学报,1995,27.247-253
  4 王立群,戈凯,郑仲承,钱关祥,刘新垣,陈诗书:中华微生物学与免疫学杂志. 1997,17,218-221
  5 吴震宇,陈诗书:上海免疫学杂志 1999.19.79-81
  6 唐展云,赖冠华,陈诗书:中国生物化学与分子生物学学报. 1999,15,48-53
  7 赖冠华,唐展云,陈诗书.生物化学与生物物理学报. 1988,30,159-163
  8 胡亮,钱关祥,沈文红,许伟榕,张腾飞,陈诗书:中国肿瘤生物治疗杂志. 1995,2,235-238
  9 钱书兵,徐荣婷,朱敏,王福庆,陈诗书.上海免疫学杂志,1988,18,271-273
  10 陆劲松,许伟榕,徐铿,钱关祥,陈诗书.上海免疫学杂志. 1997.17,103-107
  11 许旻,陆劲松,许伟榕,钱关祥,陈诗书. 中国肿瘤生物治疗杂志. 1998,5,199-203
  12 张腾飞,陈诗书. 生物化学杂志,1997,13,1-6
  13 张腾飞,孙欲晓,陈诗书. 中国肿瘤生物治疗杂志 1995,2,44-49
  14 张腾飞,陈诗书.上海免疫学杂志,1996,16,1-4
  15 张腾飞,陈诗书.中国免疫学杂志,1996,12,25-27
  16 Oian Shubing, Zhang Tengfei and Chen Shishu. Chinese Medical Journal, 1998,111,319-322
  17 钱书兵,钱关祥,陈诗书. 中华微生物学和免疫学杂志. 1998,18,505-509
  18 张腾飞,陈诗书. 胃肠病学,1999,4,6-7
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