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CD14在LPS介导Kupffer细胞活跃中的作用

2007/03/05 14:17   来源:医生在线

CD14在LPS介导Kupffer细胞活跃中的作用
世界华人消化杂志 1999年第10期第7卷 文献综述
作者:龚建平 韩本立
单位:中国人民解放军第三军医大学西南医院肝胆外科中心 重庆市 400038
关键词:多器官损伤;CD14;脂多糖;Kupffer细胞
  中国图书馆分类号 R362
  Subject headings multiple organs damages; CD14;lipopolysaccharide; kupffer cell
  感染,特别是脓毒血症(sepsis)至今仍是造成临床患者发生多脏器损伤(multiple organs damages, MOD)甚至死亡的主要原因之一. 感染造成MOD的重要机制是内毒素或脂多糖(lipopolysaccharide, lPS)活跃单核-巨噬细胞系统(mononuclear phagocyte system, MPS)释放多种细胞因子如TNF-α,IL-1,IL-6,NO等产生的介质病. kupffer细胞(KC)占整个MPS的80%~90%,是体内很大的固定巨噬细胞群;KC位于肝血窦内,与从肠道进入门静脉血的LPS密切接触;因此,它在机体防御及介导MOD两方面都起重要作用[1].近年来人们对LPS介导KC活跃的机制进行了大量研究,特别是对脂多糖受体(LPS receptor)——CD14在LPS介导KC活跃机制中的作用进行了深入细致的观察[2,3],并取得了实质性进展,现综述如下.
  1 CD14的结构特征和分类
  人类CD14的完整结构是从其基因克隆推测得知的[4],它的基因位于包含有生长因子及其受体区域的第五对染色体上,而从cDNA推测出的兔和小鼠CD14的完整结构提示它们同人类的CD14的氨基酸序列具有高度的同源性. mcGinley et al[5]采用内源性蛋白酶Asp-N溶解法,发现CD14的第57,59,65位点的天门冬氨基酸残基对Asp-N切开(cleavage)起反应,而Asp-N对CD14-LPS复合体的氨基酸残基则无此作用,说明CD14蛋白质分子的氨基酸序列中的57~64位点是LPS的结合点. viriyakosol et al[6]用基因突变策略进一步证实CD14的N末端第65位氨基酸是与其结合及其信号传导的关键部位. cD14与已知的蛋白质无明显的序列同源,其主要的可认识的结构特征是存在重复的富含亮氨酸结构的模体符(motifs),这一序列的功能尚不清楚.除了作为LPS受体外,CD14还有促使蛋白质与蛋白质相互作用的功能特征,如它能促使巨噬细胞粘附到活跃的内皮细胞和T细胞上.
  CD14存在两种类型:在髓样细胞中,CD14以糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜蛋白形式表达CD14(mCD14),但在其他一些细胞如内皮细胞和上皮细胞上因缺乏GPI,CD14以可溶性形式(sCD14)存在于血浆内. cD14的羧基末端区域的GPI粘附位点尚不清楚.阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)患者的髓样细胞缺乏mCD14,但他们血中仍能表达sCD14. pNH患者的sCD14与正常人血浆CD14是否一致仍需进一步研究.没有一种生理机制能全面解释sCD14的产生和来源,但几种可能的机制是:①加磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C到CD14阳性的细胞中能释放CD14;②在蛋白酶作用下,CD14也能从原生质膜上释放;③虽然特异性的酶仍未被鉴别,一种细胞磷脂酶D也显示能释放GPI锚定的蛋白质;另外,一些sCD14可能直接从髓样细胞系中分泌而来.还有资料显示髓样细胞外能合成CD14,这为sCD14的产生提供了另一潜在位点[4].
  2 CD14作为LPS受体的功能
  LBP作为一种LPS调理素的功能包括促进G-菌或LPS包裹的RBC(E-LPS)粘附到髓样细胞上,当E-LPS与LBP混合时,这些颗粒与单核巨噬细胞(moncytes/macrosphages,MO)形成玫瑰花形,它们的数量能用显微镜定量,这一方法首先确定了CD14是LPS(或LPS-LBP)的受体[7].应用移动的受体下调方法(mobile receptor downmodulation)揭示用抗CD14单抗(而不是其他的MO表面蛋白单抗)覆盖MO的表面,显著减少了E-LPS-LBP和人类MO之间的玫瑰花形形成.几个另外的证据也支持CD14是LPS或LPS-LBP复合体受体的观点,用抗CD14单抗或用磷酯酰肌醇特异性磷酯酶C预处理细胞,可阻止E-LPS-LBP玫瑰花形形成.
  关于LPS结合到mCD14的亲合力及化学计量的测量,Kirkland et al[8]用稳定的转染CHO-K1细胞(能表达CD14)和单核细胞系THP-1进行了研究. lPS与CD14结合是快速的、相对独立于温度的.通过磷酯酰肌醇特异性磷酯酶C处理后,95%以上的结合3H-LPS能被释放出来,一系列的抗CD14单抗能抑制LPS结合到CD14. cD14与LPS结合的恒定常数为3×10-8mol/L,LPS与CD14结合比例为1∶1以上. cD14是否有多个位点尚不清楚. 虽然LBP/LPS的研究对进一步帮助我们认识LPS活跃细胞方面迈进了很大一步.它也提出了很多重要而现在尚不能回答的问题,如mCD14这样一种不能与细胞内联系的GPI锚定蛋白怎样调节配体特异性细胞的结合信号怎样通过GPI锚定蛋白转导到胞内也困惑着我们.在考虑到CD14怎样参与信号传递之前,首先研究其他GPI锚定蛋白是怎样转导信号是重要的.在细胞活跃中,有很多GPI锚定蛋白参与,虽然在绝大多数情况下,这些蛋白的特殊配体尚未被认识.因此,细胞的活跃通常是通过抗体诱导的交叉反应而开始的,很多模型已被用来解释这些蛋白是怎样转导信号的.其中绝大多数模型中,一个重要的作用是涉及到GPI本身,即GPI锚定蛋白和Src样蛋白酪氨酸激酶相互连接,多数跨膜蛋白存在于这一联接中,特殊的脂质亚单位结构域(subdomain)可能也起作用. gPI锚定通过糖脂尾部水解释放的产物直接参与信号传导.这些研究显示蛋白质的跨膜形式不能用GPI锚定或跨膜的CD73形式获得的结果相比较,而两种形式的CD73用抗体交联后均能活跃细胞,有趣的是,后一研究证实附加的膜蛋白包括CD45、T细胞克隆性受体,Src家族酪氨酸激酶对CD73诱导的信号传导是必须的.
  有关CD14可以用生理配体LPS来研究信号传导. 为了解释mCD14作为LPS受体功能,目前提出了3种模型假说[4]:ModelⅠ—单受体学说,当LPS或LPS-LBP复合体结合到mCD14后,信号传导开始,与细胞内的信息联系由一种能识别GPI锚定的跨膜蛋白质提供,相对而言,模型Ⅱ和Ⅲ则认为LPS受体是多聚体,mCD14是主要的配体结合亚单位,而附加的跨膜蛋白诱导信号传导.多聚受体示范(paradigm)描述了许多细胞因子受体. Model Ⅱ认为与LPS结合后,mCD14经历了基本结构的变化,然后与跨膜信号分子相互作用,后者本身不与LPS结合. model Ⅲ设想在缺乏CD14时,转导分子带着低的亲合力与LPS结合,这解释了非CD14途径在与LPS的结合中起重要作用,但另外的蛋白质在信号传导中也是必要的.
  3 KC膜上CD14的表达
  CD14是MO表面存在的LPS受体,在LPS的信息传递中起启动作用[3]. kC作为肝内固定的MO群,其细胞膜上CD14的表达存在特殊性. 用Western分析法显示重组mCD14的单抗能特异性地与小鼠巨噬细胞株J774发生反应,但不与髓瘤细胞株NS1反应.荧光与免疫组化法提示rmC5-3能特异性地与KC结合;用rmc5-3免疫组化染色也显示在未受刺激小鼠的肝组织内,CD14染色阳性的KC数量少并且主要分布在中央区和门脉周围区,当其腹腔内注入内毒素(LPS)后,其数量逐渐增加,6h达高峰,20h后恢复正常.而腹腔内MO膜上CD14的表达仅有轻度改变,提示LPS能上调KC膜上CD14的表达[9]. tomita et al[10]通过对比正常人与慢性肝病患者的肝脏发现:正常肝组织内除肝窦内少数圆形细胞外,绝大多数KC不表达CD14,CD14染色阳性的KC多为圆形、多核,不同于典型的星形肝KC细胞.但在AH和CAH,绝大多数KC CD14染色均为阳性. Tracy et al[11]通过结扎大鼠胆管造成瘀胆性肝损害,发现正常肝组织用免疫荧光染色无CD14阳性的KC细胞,Western法分析提示有低水平的CD14表达,而在病理性肝脏中,用间接荧光或用抗OX42或ED9的单抗行Western分析示KC表达CD14.进一步用ED1和ED2染色发现胆管结扎3dED1与ED2阳性KC均增加,其中ED1>ED2.两种抗体染色细胞数变化反应了两种来源的KC:ED-1 KC为外来细胞,而ED-2 kC为局部增生的KC,这表明CD14的功能与肝损害有密切联系,肝损害一开始,肝内固有的KC发生表型变化而表达CD14,同时血循环中MO聚集于肝内,共同形成肝内局部的免疫防御系统,通过释放细胞因子,应答LPS的刺激.但是,有些细胞如70Z/3细胞不能表达CD14,仍能对LPS的刺激作出反应;仅表达少许CD14的KC细胞在缺乏血浆调理素情况下也能对LPS的刺激发生反应,且这类反应不被抗CD14单抗阻断,说明在KC内LPS信息传导的启动除CD14外,可能存在其他启动机制,如细胞膜上尚存一个辅助受体亚单位或第二受体[12].因此寻找出这些受体蛋白,不仅可丰富LPS受体活跃KC的基本理论,也将为脓毒血症的治疗提供新靶位.
  4 CD14在LPS介导KC活跃中的作用
  目前认为,KC活跃分四个阶段:①静止期(resident stage),表现为KC数量少、形态小,多半位于肝窦内,CD14染色多为阴性;②反应期,表现为局部KC刺激性增生及全身MO肝内聚集;③准备期( primed stage)即KC表型发生转化,表现为CD14等细胞膜受体的出现和功能发生改变;④活跃期,表现为核转录因子NF-kB的活跃、分泌及表达各种细胞因子.因此,CD14被认为是KC活跃及其功能变化的特征性标志[11].有关CD14在LPS所致KC活跃中的作用,目前尚存在争议.主要表现在下列两个方面. 多数学者认为LPS介导KC的活跃主要是通过CD14途径实现的. matsuura et al[9]报道LPS可刺激KC CD14的上调;Tracy et al[11]也报道梗阻性黄疸时KC cD14的表达明显增强,高表达的CD14对LPS具有高敏性,这可能与血循环中MO肝内聚集有关;Gupta et al[13]用70Z/3型小鼠细胞转染人的CD14发现,当转染空载体时,70Z/3细胞对低浓度LPS无反应;但70Z/3 cD14细胞对低浓度LPS产生反应,表现为表面IgM的表达、NF-kB的活跃和IkB的降解,而且LPS诱导的NF-kB能被抗CD14单抗抑制,CD14的N端156个氨基酸对LPS的反应是足够的,但CD14中N端65个氨基酸内的一个小片段发生缺失突变将显著减少对LPS的反应.这一结果表明CD14是LPS的功能受体,它在LPS所致的KC内NF-kB活跃和IgM的反应中起关键作用.
  但是,也有不少作者认为LPS介导KC活跃不依赖CD14. Bellezzo et al[14]报道LPS刺激分离的KC NF-kB活跃不依赖血浆的有无,提示CD14非依赖途径的存在;Lichtman et al[2]通过观测CD14在KC活跃和TNF-A-α释放中的作用发现:①LPS刺激KC释放TNF-α的量与有无血浆无明显关系,但RAW264.7和腹腔巨噬细胞(利用CD14受体)在缺乏血浆时释放TNF-α的量明显减少;②用磷脂酰肌醇磷脂酶C处理CD14受体后,由于CD14被裂解,RAW264.7对LPS所致的TNF-α释放明显减少,但此酶对KC释放TNF-α无影响;③去酰基化的LPS(deacylated lPS, dLPS)与LPS按100∶1的比例竞争CD14受体,这种竞争可抑制RAW264.7中LPS刺激TNF-α的释放,但对KC无此作用;④Western分析和FACS(fluorescence-actived cell sorter)分析直接发现RAW264.7及腹腔MO上存在CD14,而KC上仅存在少量CD14,并且LPS刺激不增加小鼠KC上CD14的表达.因此,他们认为分离的大、小鼠KC CD14的表达非常低,LPS刺激KC tNF-α的释放是不依赖CD14的.
  究竟CD14在LPS所致KC活跃中起何作用呢近年来Perera et al[15]通过实验对此问题作了较为圆满的解释.他们用正常或CD14基因敲除的小鼠实验发现,在低浓度LPS(<10ng/mL)刺激下,KC的活跃是通过CD14实现的,因为正常KC在此条件下可诱导TNF-α,IL-2及干扰素诱导蛋白-10(interferon-inducible protein-10, IP-10)基因的表达. 但在高浓度LPS的条件下或在无血浆条件下,CD14在LPS介导KC活跃中的作用就显得比较复杂,涉及CD14途径与非CD14途径,在反应初期,LPS首先与CD14受体结合,当CD14受体达到饱和后,LPS才与KC膜上其他LPS受体结合活跃KC. netea et al[16]也认为CD14依赖与非依赖途径可能涉及不同细胞因子的诱导,TNF-α的产生基本上是CD14依赖的,在有血浆时,LPS诱导IL-1的产生是CD14依赖的,但无血浆时,两条途径均被累及.脂质A通过两条途径刺激KC合成和分泌细胞因子,但其作用明显低于LPS的刺激,说明LPS的多糖部分是LPS活跃KC的关键部分.
  总之,有关LPS活跃包括KC在内的MPS的机制及CD14在其中的作用已取得了突破性进展[17],已证实LPS通过与KC膜上的mCD14结合而活跃多级酶联反应将信号转导到细胞核内,再通过磷酸化转录因子引起多种相关基因转录,从而参与LPS诱导的KC反应.然而,有关LPS活跃KC的确切机制,仍有诸多问题有待进一步解决,例如,CD14跨膜信号分子的鉴定,膜内信号分子的传递,NF-kB等转录因子在LPS诱导蛋白基因表达中的调控作用等等.因此,这方面的深入研究将对感染、脓毒血症、全身炎症反应综合征及MOD的理论和临床防治提供新的实验依据.
  通讯作者:龚建平
  参考文献
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收稿日期 1999-04-15

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