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低分子肝素对糖尿病大鼠肾脏病变的影响

2007/03/05 14:14   来源:医生在线

低分子肝素对糖尿病大鼠肾脏病变的影响
中华内分泌代谢杂志 1998年第4期4卷 实验研究
作者:刘元涛 袁申元 朱良湘 张京秀
单位:100005 北京首都医科大学附属同仁医院糖尿病微循环科(刘元涛、袁申元、朱良湘),检验科(张京秀)
  关键词: 肝素,低分子;实验性;糖尿病;肾病
  【摘要】 目的 研究低分子肝素对糖尿病大鼠肾脏病变的保护作用及其机制。方法 观察低分子肝素对肾小球功能、形态及肾小球基底膜超微结构的影响。结果 (1)在病程不同时期(4、8、12、16周)治疗组尿白蛋白明显低于非治疗组(P<0.05);(2)16周时,光镜及电镜下治疗组肾小球系膜增生、基底膜增厚和足突融合等病变较非治疗组明显减轻,而两组血糖、肾小球平均截面积、肾小球平均体积、肾小球滤过率及血压无明显差异(P>0.05)。结论 低分子肝素对糖尿病大鼠的肾脏病变具有一定防治作用,其机制可能不是通过改善血糖及血液动力学实现的。
  Effect of low molecular weight heparin on nephropathy in diabetic rats  Liu Yuantao,Yuan Shenyuan,Zhu Liangxiang,et al.Department of Diabetes and Microcirculation,Tong Ren Hospital,affiliated to Capital University of Medical Sciences,Beijing,100005
  【Abstract】 Objective To evaluate the protective effect of low molecular weight heparin (LMWH) on diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats and to explore  its  possible  mechanism.Methods Changes relating to glomerular function, structure and glomerular basement membrane ultrastructure were observed.Results (1)At 4,8,12 and 16 weeks, the excretion of urine albumin of LMWH-treated group was lower than that of non-treated group (P<0.05); (2)At the end of the experiment, the mesangial expansion and basement membrane thickening were obviously retarded in LMWH-treated group. But there was no difference in blood glucose level, mean glomerular area, mean glomerular volume, glomerular filtration rate and blood pressure between these two groups (P>0.05).Conclusion Low molecular weight heparin has a favorable effect on functional and morphological renal abnormalities in diabetic rats, which may not be achieved by changing glucose metabolism or improving renal haemodynamics.
  【Key words】 Low molecular weight, heparin  Experimental  Diabetes mellitus  Nephropathy
(Chin J Endocrinol Metab, 1998, 14:257~259)
  硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfate, HS)是肾小球上皮细胞及内皮细胞产生的细胞外基质之一,是维持肾小球基底膜结构、功能的重要成分,HS分布于肾小球各种固有细胞的表面,参与肾小球细胞与细胞外基质之间相互作用的调节。糖尿病状态下肾小球基底膜HS的减少与糖尿病肾病(DN)的发生有关〔1〕。肝素是临床常用的抗凝药物之一,其化学结构与HS极为相似,体外实验表明肝素及其分解产物-低分子肝素可促进肾小球内皮细胞及系膜细胞HS合成〔2〕,并明显降低糖尿病患者尿蛋白排除率〔3〕。目前肝素及低分子肝素对糖尿病肾小球功能及结构影响的系统研究尚未见报道。由于低分子肝素较少导致出血并发症,便于将来临床应用,因此,我们通过动物模型,利用生化及电镜等技术系统观察了低分子肝素对糖尿病大鼠肾小球功能及结构两方面的影响,并初步探讨其作用机理。
材料和方法
  一、动物模型制作
  选用12周雄性Wistar大鼠(体重200~250g),室温8~25℃,单只分笼,饲以蛋白含量为21%的标准料块,自由饮水。用0.1%枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(pH4.2)将链脲佐菌素(STZ)(No S-0130 Sigama)配制成0.45%的溶液,微孔滤膜过滤除菌。动物禁食10小时后,按60mg/kg剂量一次性腹腔注射,对照动物注射等容积的缓冲液。两周后将血糖大于16.5mmol/L,尿糖阳性者选定为糖尿病模型动物。
  二、实验分组与药物治疗
  对照组(10只):制模前随机选择10只健康Wistar大鼠为正常对照组,实验过程中正常饲养,不做处理。非治疗组(10只):成模后每日皮下注射与治疗组等容积的生理盐水。治疗组(12只):成模后,每日给予低分子肝素治疗(Fraxipraine, 速避凝,分子量4500,由法国Sanoofl公司提供),参照有关文献〔4,5〕及药物说明书推荐剂量,确定所用剂量约615IAXalU/kg。
  三、观察项目
  1.血糖:氧化酶法,采用美国Lifescan公司One Touch II血糖仪及血糖试纸条。2.糖化血红蛋白(HbA1c):乳胶免疫聚集抑制法〔6〕,采用德国Bayer公司DCA2000仪器及试纸盒,杀检时测定。3.尿蛋白测定:每次收集24小时尿液,以免疫散射比浊法测定。测定仪器为美国Bechkman公司的蛋白分析仪(ArrayTM protein system 360),试剂盒也由该公司提供。批内差异<5%。4.血、尿肌酐:用苦味酸法,并计算内生肌酐清除率(Ccr),由于Ccr受体表面积的影响,故我们用Ccr/kg体重加以校正。5.血压:采用中日友好医院临床医学研究所生产的RBP-1型大鼠血压计,经大鼠尾部测量其动脉收缩压,盲法测定。6.形态学观察:光镜(LM)观察:杀检取肾皮质,10%中性福尔马林固定,乙醇脱水,石蜡包埋,制成4μm石蜡切片,PAS染色,光镜下,分别观察肾小球形态、大小、系膜基质扩展程度。将石蜡切片用图像分析仪(Cambrige Instruments QUANTIMENT 970 QUIPS:VO 8.02;军事医学科学院仪器测试中心)对肾小球进行定量分析,考虑到肾小球包曼氏囊腔大小不等,而毛细血管丛能比较客观地反映肾小球的变化,故通过对肾小球毛细血管横切面的立体定量分析来反映肾小球的变化。测量参数包括:肾小球平均截面积,肾小球平均体积。每个肾脏标本切片随机测量20个肾小球,取其平均值。透射电镜(TEM)观察:取肾皮质组织,切成1mm3大小组织数块,经2.5%戊二醛前固定,1%锇酸后固定,EPON812包埋,超薄切片,铅铀染色,电镜(JEM-2000EX, JAPAN)下观察,同时对肾小球毛细血管基底膜摄影(12000倍),每例标本随机至少取10张不同部位的照片,将切片按立体学定量分析原理,用图像分析仪(同上)对肾小球基底膜(GBM)进行定量测量,取其平均值作为每一例标本的GBM厚度。
  四、统计学处理
  结果以表示。组间比较用方差分析,两组比较用Student-Newman-Keuls检验。所有数据用SPSS for windows 6.0处理。
结  果
  一、一般情况,血肌酐及内生肌酐清除率
  血 糖及糖化血红蛋白显著 高于对照组(P<0.01),而体重显著低于对照组(P<0.01)(表1)。治疗组未见出血倾向,经统计学处理,三组之间血压及血肌酐无显著性差异(P>0.05)。与对照组相比,非治疗组及治疗组内生肌酐清除率均明显增高(P<0.01),见表1。
表1 代谢指标与体重、血压的测定结果
  Tab 1 Results of metabolic parameters、body weight and blood pressure
项目
  Items
对照组
  Control group
非治疗组
  Untreated group
治疗组
  Treated group
FBG(mmol/L) 4.10±0.91 20.25±2.50* 19.56±2.62*
HbA1c(g/dl) 5.36±0.13 9.26±0.55* 9.10±0.83*
Weight(g) 515.00±49.24 313.00±70.85* 312.50±42.52*
Cr(umol/L) 40.17±6.60 45.85±6.35 40.50±6.60
CCr(ml*min-1/kg) 5.09±0.24 5.83±1.34* 5.94±1.31*
Bp(kPa) 17.90±1.90 18.87±1.97 17.82±1.68
  注:与对照组比较 vs control group,*P<0.01 表2 24小时尿白蛋白定量的动态变化(mg/24hr)
  Tab 2 Dynamic changes of urinary albumin excretion(mg/24hr)
< < <
组别
  groups
0周
  0 week
4周
  4th week
8周
  8th week
16周
  16th week
对照组
  Control
0.18±0.06 0.17±0.04 0.18±0.10 0.21±0.08
非治疗组
  Untreated
0.22±0.08 1.77±0.78* 2.21±1.05* 2.84±1.12*
治疗组
  Treated
0.24±0.09 1.40±0.67*△ 1.42±0.65*△ 1.55±0.80*△
  注:与对照组比较 vs control group,*P<0.01;与非治疗组比较 vs untreated group,P<0.05
  二、尿蛋白改变
  对照组在16周观察期间尿白蛋白排出量无明显改变,治疗与非治疗组在4周后尿白蛋白即显著高于对照组,且随病程延长逐渐增多,16周时达到高峰。各时期治疗组尿白蛋白较非治疗组明显减少(P<0.05),但仍未降至对照组水平,见表2。
  三、形态学检查
  光镜检查(LM):与正常组比较,非治疗组可见肾小球明显肥大,经定量分析与对照组比较有显著差异(P<0.01)(表3),治疗组肾小球肥大较非治疗组有所减轻,但仍未降至正常水平(P<0.01)。
  表3 肾小球平均截面积、平均体积及基底膜厚度测定结果
  Tab 3 Results of mean glomerular area (MGA), mean glomerular volume (MGV) and glomerular basement membrane thickness (GBMT)
组别
  Groups
平均截面积
  MGA
  (×10-3mm2)
平均体积
  MGV
  (×10-4mm3)
基底膜厚度
  GBMT
  (nm)
对照组
  Control
6.61±1.24 4.25±1.18 184.79±295.46
非治疗组
  Untreated
10.35±2.15* 7.33±1.01* 295.46±45.09*
治疗组
  Treated
9.84±1.78* 6.97±2.00* 213.18±45.08
  注:与对照组比较 vs control group,*P<0.01;与非治疗组比较 vs untreated group,P<0.05
  透射电镜观察:非治疗组基底膜较对照组明显增厚(P<0.01),治疗组较非治疗组显著减轻(P<0.01)。此外,非治疗组可见广泛足突融合,而治疗组足突融合不明显,见表3。 讨  论
  糖尿病肾病是糖尿病严重慢性并发症之一,其发生率约占1型糖尿病人的30%~40%〔7〕。微量白蛋白尿是糖尿病肾病早期标志之一,其发生被认为是肾小球负电屏障损伤的结果。硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfate, HS)是一种氨基多糖,由肾小球内皮细胞及系膜细胞产生,是构成肾小球基底膜重要的细胞外基质成分之一,对维持基底膜结构完整具有重要作用。此外,HS本身带有负电荷,是构成肾小球负电屏障的主要成分〔1〕,糖尿病状态下,HS合成减少可能是导致肾小球负电屏障损伤的重要原因〔1〕。低分子肝素是从普通肝素中分离或降解而来,其结构与HS极为相似,二者皆为带负电荷的氨基多糖〔5〕。本研究证实低分子肝素可显著降低糖尿病大鼠的尿白蛋白排除率,其作用机制目前尚不清楚,推测可能与以下机制有关:(1)肾小球基底膜具有肝素受体〔8〕,低分子肝素可能直接与该受体结合,替代HS发挥负电屏障作用,阻止带负电的白蛋白由基底膜漏出;(2)促进肾小球细胞产生内源性HS合成〔2〕
  糖尿病肾病早期常存在肾小球血液动力学异常,本实验结束时,模型动物内生肌酐清除率、肾小球平均截面积、肾小球平均体积均明显高于对照组,这与文献报道一致。有作者认为肾小球血液动力学异常也是导致微量白蛋白尿的一个重要因素,而本研究发现低分子肝素虽明显减少白蛋白尿,但对肾小球血液动力学的指标却无显著影响。提示其作用机制可能不是通过改善肾小球肾血液动力学而实现的。
  本研究发现低分子肝素除降低蛋白尿外可显著抑制糖尿病大鼠肾小球基底膜增厚及系膜区增宽,而上述病变正是肾小球硬化的早期特征病理改变,免疫组化表明低分子肝素可显著抑制肾小球某些细胞外基质成分的增加(另文发表)。因此,我们认为,低分子肝素对于糖尿病肾小球硬化可能具有一定的防治作用。
  目前关于糖尿病肾病的发病机制尚未完全阐明,但高血糖及肾血流动力学异常是导致糖尿病肾病发生的重要危险因子,而低分子肝素对上述指标似无明显作用。这部分解释了为什么低分子肝素虽对糖尿病肾病的发生具有一定防治作用,却不能完全阻止其发生的原因。我们推测低分子肝素若与降糖药或改善肾血流动力学药物(如血管紧张素转化酶抑制剂)联合应用可望取得更好的防治效果。
参 考 文 献
  1  Tamsma JT, Born van den J, Bruijn JA, et al. Expression of glomerular extracellular matrix components in human diabetic nephropathy: decrease of heparan sulfate in hte glomerular basement membrane. Diabetologia, 1994,37:313-320.
  2 Neder HB, Buonassisi V, Oolburn P, et al. Heparin stimulates the synthesis and modifies the sulfation pattern of heparan sulfate proteoglycan from endothelial cells. J Cell Physiol, 1989,140:305-310.
  3 Tamsma JT, Woude van der FJ, Lemkes HHPJ. Effect of sulphated glycosaminoglycans on albuminuria in patients with overt diabetic (type 1) nephropathy. Nephrol Dial Transplant, 1996,11:182-185.
  4  Verstraete M. Pharmacotherapeutic aspects of unfractioned and low molecular weight heparins. Drugs, 1990,40(4):498-530.
  5 Hirsh J, Levine MN. Low molecular weight heparin. Blood, 1992,79(1),1-17.
  6 Crine JE. Latex agglutination immunoassays. Am Lab, 1987,May/June:34.
  7 Meyer TW. Mechaisms of proteiuria I diabetic real disease. Semi Nephrol, 1990,10:194.
  8 Danne T, Spiro MJ, Spiro RG. Effect of high glocose on type IV collagen production by cultured glomerular epithelial, endothelial and mesangial cells. Diabetes, 1993,42:170-177.
(收稿:1998-01-9 修回:1998-07-13)

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